Năm 1944, Oswald Avery đã khám phá ra chất biến nạp để truyền các đặc tính di truyền được của phế cầu khuẩn gây bệnh (Streptococcus pneumoniae) không phải là protein hay lipid, mà theo ông nhận xét nhiều khả năng là axit deoxyribonucleic (DNA). Trong thí nghiệm của họ, ông cùng các cộng sự Colin MacLeod và Maclyn McCarty (và dựa trên kết quả thí nghiệm Griffith trước đó) đã đề xuất DNA là phân tử chịu trách nhiệm truyền tải thông tin di truyền. Sau đó, Erwin Chargaff (1950) khám phá ra thành phần DNA có sự khác nhau giữa các loài. Các thí nghiệm này đã mở đường dẫn đến khám phá ra cấu trúc của phân tử DNA. Năm 1953, nhờ kết quả của ảnh chụp tinh thể tia X của Maurice Wilkins và Rosalind Franklin, James Watson và Francis Crick đưa ra cấu trúc của DNA có dạng chuỗi xoắn kép.[1]

Trong thập niên 1960, một trong những bí ẩn chính về DNA mà các nhà khoa học cần nghiên cứu khám phá đó là số lượng các base tìm thấy trong mỗi mã, hay codon, tham gia vào quá trình phiên mã. Các nhà khoa học đã biết rằng có bốn base xuất hiện trong đơn vị mã di truyền gốc (guanine, cytosine, adenine, và thymine). Họ cũng biết rằng có 20 axit amin trong tự nhiên. Nhà khoa học George Gamow đã đề xuất mỗi mã di truyền chứa bộ ba nucleotide mã hóa tương ứng cho một axit amin. Ông lập luận rằng bởi vì có 20 axit amin và chỉ có 4 base, mã di truyền không thể chỉ gồm 1 base (cho tổ hợp 4 kết quả) hoặc chứa 2 base (tổ hợp 16). Do vậy, ông nghĩ rằng bộ ba (cho tổ hợp 64 bộ) sẽ là đơn vị mã hóa của mã di truyền. Tuy nhiên, ông cho rằng các bộ ba xếp đan xen và không suy biến (codon degeneracy)[2] (sau đó được Crick giải thích bằng khái niệm Wobble của ông).

Trong thập niên 1950, Seymour Benzer đã phát triển phương pháp xét nghiệm sử dụng đột biếtn ở vùng rII thể thực khuẩn T4 (có 2 gene cạnh nhau gọi là cistrons A và B).[3][4] Với hệ thống này, Benzer đã cung cấp bản đồ cấu trúc chi tiết đầu tiên về một vùng gene, trong trường hợp này là bộ gene của thể thực khuẩn T4. Mặc dù chưa có khả năng giải trình tự DNA, Crick và đồng nghiệp đã tự thuyết phục rằng họ có thể dùng phương pháp đột biến điểm và tái tổ hợp di truyền của hệ thống T4 rII để lập ra vị trí thay đổi ở vùng gene này và thiết lập lên bản chất chung của mã di truyền. Bản đồ của Benzer về vùng T4 rII là phù hợp với kết luận rằng mỗi gene là tổ hợp các trình tự thẳng của nucleotide, và mỗi một gene trong số đó có thể trải qua sự thay đổi mang tính di truyền được mà khiến thay đổi protein sản phẩm. Chuỗi polypeptide cũng chứa một trình tự thẳng axit amin như đã được xác lập trong thập niên 1950 bởi Frederick Sanger và cộng sự.[5] Sau đó, vào cuối thập niên 1950, Vernon Ingram chỉ ra rằng đột biến chuỗi polypeptide hemoglobin ở người là do sự thay đổi ở một axit amin.[6] Kết luận logic rút ra từ những kết quả trên và các nghiên cứu liên quan đó là mỗi gene chứa một trình tự thẳng duy nhất các nucleotide, và mỗi trình tự này được phiên mã thành một trình tự thẳng duy nhất các axit amin. Nếu cách giải thích này là đúng, thì phải có một “mã di truyền” liên hệ giữa trình tự nucleotide của mỗi gene với trình tự axit amin mà nó mã hóa cho protein.[7] Trong thí nghiệm Crick, Brenner et al. sau đó, sử dụng 3 thể thực khuẩn, bản chất bộ ba của mã di truyền đã được xác nhận. Họ sử dụng đột biến dịch chuyển khung (frameshift mutations) và quá trình đảo ngược, để thêm hay xóa 1, hoặc 2 hoặc 3 cặp nucleobase.[8] Khi một bộ 3 nucleotide được thêm hay xóa vào trình tự DNA, họ nhận thấy protein được mã hóa bởi trình tự này chủ yếu không bị thay đổi (trong khi thực hiện đối với 1 hoặc 2 nucleotide thì không tổng hợp ra được protein). Do vậy, họ kết luận rằng mã di truyền bao gồm các bộ ba bởi vì chúng không gây ra sự dịch chuyển khung trong khung đọc.[9] Họ đã kết luận đúng rằng mã di truyền là suy biến (degenerate) (các bộ ba không đan xen chồng lợp) và mỗi trình tự nucleotide được đọc từ một điểm xác định (codon khởi động hay kết thúc).[10]

Cả Marshall Nirenberg và Johann Matthaei từ lâu đã muốn tìm hiểu làm cách nào mà thông tin được truyền từ DNA sang protein. Ở thời điểm này có một cuộc chạy đua giải mã bí mật trong trình tự DNA. Khi ấy, Severo Ochoa đang bận nghiên cứu về vấn đề mã hóa cùng với sự hỗ trợ của Leon Heppel, một nhà hóa sinh tài năng có khả năng tổng hợp được RNA nhân tạo từ các thành phần định trước. Ochoa có một đội ngũ nghiên cứu viên đông đảo, và Nirenberg cảm thấy lo lắng là ông không thể theo kịp. Nhiều nhà khoa học ở NIH đã tham gia vào hỗ trợ Nirenberg để giải mã codon trên mRNA cho axit amin.[11] Nirenberg và nghiên cứu sinh hậu tiến sỹ Matthaei đã bắt đầu thực hiện thí nghiệm và hoàn thành nó ở một phòng thí nghiệm thuộc National Institutes of Health (NIH) nằm ở Maryland.[2]